弧菌通用探针法荧光定量PCR试剂盒

弧菌通用探针法荧光定量PCR试剂盒

英文名称：Vibrio spp.

运输：低温

保存：负20度

有效期：一年

货期：1-2周

其他： 

产品介绍：

产品及特点 弧菌（Vibrio spp.）是菌体短小，弯曲成弧形，尾部带一鞭毛的革兰氏阴性菌。弧菌属广泛分布于河口、海湾、近岸海域的海水和海洋动物体内。该菌引起的食物中毒经烹饪不当的海产品或盐腌制品所传播。常见的为海蛰、海鱼、海虾及各种贝类，因食物容器或砧板生熟不分污染本菌后，也可发生食物中毒。该菌常年均可发生，可从自限性腹泻至中度霍乱样病症，有腹痛、腹泻、呕吐和低热，粪便多为水样，少数为血水样，恢复较快，病后免疫力不强，可重复感染，该菌还可引起浅表创伤感染、败血症等，给人体健康带来严重损害，因此弧菌检测具有重要的意义。荧光定量 PCR 是检测传染性疾病的主流技术，本产品就是以探针法荧光定量 PCR 技术为基础开发的专门检测弧菌的通用试剂盒，它具有下列特点：

1. 即开即用，用户只需要提供样品 DNA 模板。

2. 引物和探针经过优化，灵敏性高。

3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4. 特异性高，引物是根据人弧菌高度保守区设计，不会跟其他微生物的 DNA发生交叉反应。

5. 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 PCR 反应。

6. 本产品只能用于科研

运输及保存 低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。

自备试剂 样品DNA。

使用方法 一、稀释标准曲线样品（以10E2-10E7拷贝/μL这6个10倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。

1. 标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。

2. 用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。

3. 在7号管中加入5 μL 1×10E8拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10E7拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

4. 换枪头，在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

5. 换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

6. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品DNA的制备

7. 如果有N个样品，最好设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL阳性对照的10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。

8. 用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数细菌DNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的细菌DNAout或柱式细菌DNAout。本试剂盒免费赠送20次免DNA提取的核酸释放剂，本产品的裂解液可以直接作为PCR模板，省略了DNA提取步骤。

三、Probe qPCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）

9. 如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），1个用于PCR阳性对照（用第4号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：

成分 样品管

N+2个 PCR阴性对照管 标准曲线

样品管（2-7管）

2×Probe qPCR MagicMix 10 μL 10 μL 各10 μL

副溶血性弧菌qPCR探针 2 μL 2 μL 各2 μL

副溶血性弧菌探针法qPCR引物混合液 2 μL 2 μL 各2 μL

 N+2个待测DNA模板 6 μL 不加 不加

超纯水 不加 6 μL 不加

第7步所得标准曲线样品稀释液（2-7号） 不加 不加 各6μL（2号样到2号管，3号样到3号管…）

11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：

过程 温度 时间

预变性 94℃ 5 min

PCR反应

（40个循环） 94℃ 0.5 min

55℃ 0.5 min（采集FAM通道的荧光信号）

72℃ 0.5 min

最后延伸 72℃ 10 min

五、数据处理

12. 以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。

六、电泳检测

13. 如果有必要电泳确认，可取10-20 uL PCR产物直接在琼脂糖凝胶上电泳产物的大小为400 bp。但电泳非常容易污染实验环境，建议不轻易采纳。