羊关联恶性卡他热病毒染料法荧光定量PCR试剂盒

羊关联恶性卡他热病毒染料法荧光定量PCR试剂盒

英文名称：Sheep-associated Malignant Catarrhal Fever Virus ( SA-MCFV，同羊疱疹病毒2型) 

运输：低温

保存：负20度

有效期：一年

货期：2-3周

其他： 

产品介绍

产品及特点

羊关联恶性卡他热病毒(Sheep-associated Malignant Catarrhal Fever Virus，SA-MCFV)是一种存在于上皮细胞屑中的病毒，能够引发以体表无毛处皮肤痘疹，能够使上呼吸道、口腔和食管部黏膜形成纤维素性坏死假膜。该病毒对外界是环境的抵抗力相当强，在上皮细胞屑中的病毒，虽然完全干燥和被直射日光作用许多星期，还不致被杀死；加热至60℃需经3小时才被杀死，在-15℃以下的环境中可保持活力多年。1%的火碱、1%的醋酸或0.1%的升汞可于5分钟内杀死此病毒，较强的抵抗力对羊的健康有巨大的潜在危害，因此羊关联恶性卡他热病毒的快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用，为此本公司开发了简单快捷的羊关联恶性卡他热病毒染料法荧光定量PCR检测试剂盒，它具有下列特点：

1. 即开即用，用户只需要提供病毒样品。

2. 根据羊关联恶性卡他热病毒保守序列设计的专一性引物，与相关病毒无交叉反应。

3. 灵敏度可以达到几百拷贝/反应。

4. 一管式荧光定量PCR检测，避免后续污染。

5. 本试剂盒足够50次20μL反应体系的荧光定量PCR。

6. 本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。

运输及保存 低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。

自备试剂 样品DNA。

使用方法 一、制备标准曲线样品（以10E2-10E7拷贝/μL这6个10倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。

1. 标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。

2. 用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。

3. 在7号管中加入5 μL 阳性对照（其浓度为1×10E8拷贝/μL，试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10E7拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

4. 换枪头，在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

5. 换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

6. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品DNA的制备

7. 用自选方法纯化样品的DNA，本产品跟市场上绝大多数核酸纯化产品兼容。

8. 如果有N个样品，则需要进行N+2个样品提取，多出的一个用作样品制备阳性对照管、另一个用作样品制备阴性对照管。如果用本试剂盒自带的DNA释放剂试用装。则按下面步骤操作：

9. 配制溶液A工作液。以配制1mL工作液（足够10个样品）为例：在一干净塑料管中加入10μL溶液A成分一，20μL溶液A成分二和970μL超纯水，充分混合均匀即可。溶液A工作液可室温放置，但最好在一周内用完，不要长期放置。一次检测一个样品需要100μL溶液A工作液，1mL工作液足够10个样品。如果待测样品数量为其他数字，配制的溶液A工作液的体积需要做相应的调整。

10. 在标记好的N+2个离心管中，加入1-5mg（半粒芝麻大小）固体待测样品或5μL液体待测样品。在样品制备阳性对照中加入5μL阳性对照，在样品制备阴性对照中加入5μL水。

11. 在每个管中加入100 μL溶液A工作液，确保固体样品被溶液淹埋，如果是液体样品则震荡混匀。

12. 95℃保温10分钟。

13. 待冷却到常温后加入10μL溶液B并混匀得DNA释放液。每个样品得到的DNA释放液足够进行50-100次PCR。

三、设置qPCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）

14. 如果只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照，6个用于标准曲线样品。如果做2-3次重复，则反应设置数量相应增加2或3倍。

15. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：

成分 样品管

N+2个 PCR阴性对照管 标准曲线

样品管（2-7管）

2×qPCR MagicMix

（棕色管） 10 μL 10 μL 各10 μL

血吸虫通用 PCR引物混合液（白盖） 2 μL 2 μL 各2 μL

自备10×ROX (见注) 2 μL 2 μL 各2 μL

 待测样品DNA模板 6 μL 不加 不加

第7步所得标准曲线样品稀释液（2-7号） 不加 不加 各6μL（2号样到2号管，3号样到3号管…）

注:仅ABI7500、7700和7900仪器需要使用ROX作为对照，其他荧光PCR仪器（如iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000和LightCycler480）不需要使用ROX，则用水替代。

16. 盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR（具体PCR参数可以根据仪器不同而自行优化）。

四、荧光定量PCR反应参数

过程 温度 时间

预变性 94℃ 5 min

PCR反应

（35个循环） 94℃ 0.5 min

50℃ 0.5 min（采集SYBR通道的荧光信号）

72℃ 0.5 min

最后延伸 72℃ 10 min

五、数据处理

17. 设定60℃-96℃范围的融解曲线分析，排除假阳性。

18. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。

19. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。

五、电泳检测

20. 如果有必要电泳确认，可取10-20 μL PCR产物直接在琼脂糖凝胶上电泳产物的大小为400 bp。