猪流行性腹泻病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

猪流行性腹泻病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

英文名称：Porcine Epidemic Diarrhea Virus(PEDV)

运输：低温

保存：负20度

有效期：一年

货期：2-4周

其他：

产品介绍：

产品及特点 猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种急性、高度接触性肠道传染病，对养猪业的危害极大，所以及早确诊对该病的防治具有特别重要的意义。猪流行性腹泻病毒的传统诊断方法主要有病毒的分离鉴定、免疫荧光抗体试验、免疫电镜观察和ELISA等方法。但这些方法操作过程繁琐、操作难度大，所需要时间较长，专一性不强因此建立一种快速、高灵敏度的诊断方法对防治PEDV感染是十分必要的。本产品就是针对这一需求开发的实时定量RT-PCR产品，它具有下列特点：

1. 灵敏度高，分析灵敏度可以达到50拷贝/uL，远高于常规方法，也比常规的RT-PCR检测高100倍。

2. 特异性高，根据PEDV的ORF3基因保守区设计引物，不会误检其他猪的病原性病毒（如猪轮状病毒、猪圆环病毒、猪传染性胃肠炎、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒和猪瘟病毒等）。

3. 一管封闭式，避免了RT-PCR产物对后续RT-PCR的污染。

4. 线性范围广，在10-107拷贝/uL的靶分子浓度范围内均呈线性。

5. 简单快捷，只需要2小时即可得到实验结果。

运输及保存 低温运输、-20℃保存，有效期一年。

自备试剂 样品。

使用方法 一、样品RNA的制备

用自选方法纯化PEDV样品的RNA，也可以另购本公司的病毒RNAout或柱式病毒RNAout，上述两款产品跟本试剂盒兼容。

二、制备PEDV标准曲线

1. 标记6个离心管，分别为1,2,3,4,5和6号。

2. 用带芯分别加入45 uL超纯水（最好用带芯枪头，下同）。

3. 在1号管中加入5 uL PEDV阳性对照(本试剂盒提供)，充分震荡1分钟。

4. 换枪头，从1号管中取5 uL溶液到2号管中，充分震荡1分钟。

5. 换枪头，从2号管中取5 uL溶液到3号管中，重复上面的操作直到得到6个稀释度的样品。

6. 从6个管中分别取5 uL进行定量RT-PCR（见下步），每个样品最好重复3次。

三、荧光定量RT-PCR反应（30 uL体系）

7. 在PCR管中加入下列成分（每个样品最好重复三次，这里只列出一次）：

成  份 样品 6个阳性对照（见制备PEDV标准曲线） 阴性对照

PEDV专一性引物对 2 uL 2 uL 2 uL

样品RNA 5 uL 无 无

PEDV阳性对照（XXX拷贝/uL） 无 5 uL（每个管加一个稀释度的对照） 无

自备1×ROX (见注) 2 uL 2 uL 2 uL

补超纯水到 15 uL 15 uL 15 uL

即用型荧光RT-PCR Mix 15 uL 15 uL 15 uL

注：仅ABI7500、7700和7900仪器需要使用ROX作为对照，其他荧光PCR仪器（如iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000和LightCycler480）不需要使用ROX。

此处阴性对照用的是水，用户也可以用其他RNA做阴性对照。

8. 轻柔混匀后上机，按下面参数进行定量RT-PCR，反应参数如下：

过程 温度 时间 其他

RT（逆转录） 42℃ 5分钟

预变性 95℃ 2分钟

PCR反应

（40个循环） 94℃ 15 s

62℃ 25 s 收集荧光数据，所选择波长见注。 

溶解曲线分析判断产物特异性 加热到95℃ 10分钟，然后降低到55℃后，按0.5℃/10s的升幅将温度提高到95℃，其间记录下荧光信号的变化。特异的PEDV PCR扩增产物将在82.2℃产生特异峰。

注：本产品所用荧光染料跟RNA结合时的最大光吸收是500 nm，最大发射波长是530 nm，不同PCR产物（DNA片段）结合时最大吸收波长是471 nm，无发射。 

四、数据处理

9. 以PEDV阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再用浓度的的log为横轴，以Ct值为纵轴，通过待测样品的Ct值反推出样品RNA的浓度。