小反刍兽疫病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

小反刍兽疫病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

英文名称：Peste Des Petits Ruminants Virus(PPRV)

运输：低温

保存：负20度

有效期：一年

货期：2-4周

其他：

产品介绍：

产品及特点

小反刍兽疫(Peste des Petits Ruminants, PPR)是由副黏病毒科麻疹病毒属的 小反刍兽疫病毒( Peste des Petits Ruminants Virus, PPRV) 引起的急性、烈性传 染病。它是世界动物卫生组织(OIE)法定的 A 类传染病,我国将其定为Ⅰ类动物疫病。 本产品就是专门用于小反刍兽疫病毒的快速荧光 RT-PCR 检测的试剂盒，在动物或 者动物产品的检测领域有广泛用途，它具有下列特点：

1. 即开即用，用户只需要提供病毒 RNA 模板。

2. 两管式 RT-PCR，一次 RT 反应产物可以作为多次 PCR 的模板。本试剂盒提供 5 次的 20 uL 体系的 RT 反应试剂和 25 次的 50 uL 体系的荧光 PCR 试剂。

3. 使用 RNase H 已经突变的 SuperMMLV 逆转录酶，减少了 RT 过程中 RNA 的 降解。

4. 使用热启动的 Taq DNA 聚合酶，降低了非特异性扩增。

5. 荧光定量检测，所含 SYBR Green I 只与双链 DNA 结合，反应特异性强。适用 于不需要 ROX 做校正染料的荧光 PCR 仪。

6. 产品的有效线性范围广，定量更加准确。

7. 引物经过优化，特异性高，引物是根据保守的 N 基因设计，产物长度为 1416 bp。

运输及保存 低温运输，-20℃避光保存，有效期为 6 个月。

自备试剂 样品 RNA。

使用方法 一、样品 RNA 的制备

1、用自选方法抽提病毒样品 RNA。注意：可以选用本公司生产的一管式病毒 RNAout 或柱式病毒 RNAout。

二：RT（逆转录）反应合成 cDNA

2、按下表配制 RT 反应体系（20 uL 体系）:

成分 用量 RNA 模板(自备) 由于一般不知病毒

RNA 浓度,用 1-10 uL 即可

PPR 专一性引物二 2 uL

RNase-free 水 补水到 13 uL

70℃保温 5 分钟变性模板后立即冰浴。

RT Buffer(含 dNTP) 5 uL

37℃保温 5 分钟

SuperMMLV 逆转录酶 2 uL

42℃保温 60 分钟。此步为 RT 反应。

70℃保温 10 分钟以终止反应，然后放置在冰上待用。合成的 cDNA 可以 直接作为 PCR 模板使用，不需要纯化。

三、荧光 PCR（50 uL 体系）

3、在 PCR 管中加入下列成分(注:做多少阳性对照稀释度由客户自己决定。拷贝数可 以通过浓度和长度计算而得。本阳性对照长度为 1416bp)：

成分 样品管 阳性对照(1-8 管) 阴性对照

2×qPCR Mix 25 uL 25 uL 25 uL

cDNA 样品（上步的 RT 反应液） 1-5 uL 无 无

阳性对照(可以稀释 1-8 个梯度) 无 1-8 个稀释度 无

PPRV 专一性引物一 2 uL 2 uL 2 uL

PPRV 专一性引物二 2 uL 2 uL 2 uL

补水到 50 uL

4、PCR 反应参数（以 ABI7500 荧光定量 PCR 仪为参考）：

过程 温度 时间

预变性（此步用于活化 热启动 Taq 聚合酶） 95℃ 10 min

PCR 反应 （35-40 个循环） 94℃ 1 min 55℃ 1 min 72℃ 2 min

融解曲线分析 95℃ 15 s 60℃ 1 min 95℃ 15 s 60℃ 15 s

5、 根据阳性对照梯度的 Ct 值和浓度描出标准曲线，用于计算样品的浓度。