日本脑炎病毒探针法荧光定量RT-PCR试剂盒

日本脑炎病毒探针法荧光定量RT-PCR试剂盒

英文名称：Japanese Encephalitis Virus(JEV)

运输：低温

保存：负20度

有效期：一年

货期：2-3周

其他： 

产品介绍：

产品及特点

日本脑炎又称为流行性脑炎。该病是日本脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus)引起的影响中枢神经的急性传染病。在亚洲与东南美洲日本脑炎流行十分 普遍。在美国的塞班岛与澳洲大陆等地区也出现了日本脑炎的病例。日本脑炎是 自然病毒引起，人、动物与大多数家禽都可能感染日本脑炎。在 10 岁以下，尤 其是 2-6 岁的儿童中传播最广。主要的症状为发烧、抽筋与深度昏迷。超过一半 的存活儿童，在发病一年后仍有脑波之异常。四分之三的存活者，在发病五年后， 仍然有行为或精神状态方面之异常。因此快速灵敏诊断具有重要意义。本产品就 是以探针法荧光定量 RT-PCR 技术为基础开发的专门检测日本脑炎病毒的试剂盒， 它具有下列特点：

1. 即开即用，用户只需要提供样品 RNA 模板。

2. 引物和探针经过优化，灵敏性高。

3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4. 特异性高，引物是根据甲型流感（禽流感）病毒高度保守区设计，不会跟其 他病毒的 RNA 发生交叉反应。

5. 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 RT-PCR 反应。

6. 本产品只能用于科研。 

运输及保存 低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。

自备试剂 样品 RNA。

使用方法 一、稀释标准曲线样品（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。 由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能 污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本 产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。

1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 RT-PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪 头，下同）。

3. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震 荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

4. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

5. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品 RNA 的制备

7. 如果有 N 个样品，最好设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性 对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 阳性对照的 10000 倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为 PC。另外用水作为 NC。

8. 用自选方法纯化样品的 RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA 提取试剂 盒兼容。也可以选购本公司的柱式病毒 RNAout。本试剂盒免费赠送 20 次 免 RNA 提取的核酸释放剂试用装，该释放剂的裂解液可以直接作为 RT-PCR 模板，省略了 RNA 提取步骤。

三、Probe qRT-PCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）

9. 如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个 用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），6 个 用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用 水做模板），1 个用于 PCR 阳性对照（用第 4 号管的阳性对照稀释液做模 板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设 置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好 后最后加）：

成分 样品管 N+2 个 RT-PCR 阴性对照 管 标准曲线 样品管 （2-7 管）

2×Probe qRT-PCR MagicMix 各 10 μL 10 μL 各 10 μL

甲型流感病毒 qRT-PCR 探针 各 1 μL 1 μL 各 2 μL

甲型流感（禽流感）病毒 RT- 各 2 μL 2 μL 各 2 μL

PCR 引物混合液

待测样品 RNA 模板 各 6 μL 不加 不加

超纯水 不加 6 μL 不加

第 7 步所得标准曲线样品稀释液 （2-7 号） 不加 不加 各 6μL（2 号 样到 2 号管， 3 号样到 3 号 管…）

11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 RT-PCR：

过程 温度 时间

你转录 42℃ 30 min

预变性 95℃ 5 min

RT-PCR 反应 （40 个循环） 93℃ 0.5 min 55℃ 0.5 min（采集 FAM 通道的 荧光信号） 72℃ 0.5 min

最后延伸 72℃ 10 min

五、数据处理

12. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值 为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 RNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。

13. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大 于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该 小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小 于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于 40 则为阴性，如果小于 40，则为阳性。