副猪嗜血杆菌染料法荧光定量PCR试剂盒

副猪嗜血杆菌染料法荧光定量PCR试剂盒

英文名称：Haemophilus parasuis

运输：低温

保存：负20度

有效期：一年

货期：2-3周

其他： 

产品介绍

产品及特点

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis, HPS)属巴斯德氏菌科嗜血杆菌 属，是一种依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)且没有运动性的小型、多形性、 革兰氏阴性杆菌。HPS 可引起猪多发性浆膜炎、关节炎，严重时导致体温升 高、呼吸困难甚至死亡, 给养猪业带来巨大的经济损失。目前对 HPS 的诊断 主要是细菌分离培养和 PCR。HPS 培养需要 NAD、马血清和 5% CO2 环境， 需 24-36 小时，还容易出现杂菌污染，因此 PCR 是目前诊断 HPS 最常用的 方法。本产品就是基于 PCR 的 HPS 检测试剂盒，它具有下列特点：

1. 灵敏度高，分析灵敏度可以达到 50 拷贝/uL，远高于细菌培养法。

2. 特异性高，根据 HPS 的 16S rDNA 基因保守区设计引物，可扩增出强、 中和弱毒力的各种 HPS 血清型，但不会误检猪链球菌 2 型、猪伤寒沙门 氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等常见无关细菌。

3. 一管封闭式，避免了 PCR 产物对后续 PCR 的污染。

4. 线性范围广，在 10-107拷贝/uL 的靶分子浓度范围内均呈线性。

5. 简单快捷，只需要 2 小时即可得到实验结果。 规格及成分 成 份 50 次塑料袋包

运输及保存低温运输、-20℃保存，有效期一年。

自备试剂样品。

使用方法 一、样品 DNA 的制备

用自选方法纯化 HPS 样品的 DNA，也可以另购本公司的细菌 DNAout

或柱式细菌 DNAout，上述两款产品跟本试剂盒兼容。

二、制备 HPS 标准曲线

1. 标记 6 个离心管，分别为 1,2,3,4,5 和 6 号。

2. 用带芯分别加入 45 uL 超纯水（最好用带芯枪头，下同）。

3. 在 1 号管中加入 5 uL HPS 阳性对照(本试剂盒提供)，充分震荡 1 分钟。

4. 换枪头，从 1 号管中取 5 uL 溶液到 2 号管中，充分震荡 1 分钟。

5. 换枪头，从 2 号管中取 5 uL 溶液到 3 号管中，重复上面的操作直到得到

6 个稀释度的样品。

6. 从 6 个管中分别取 5 uL 进行定量 PCR（见下步），每个样品最好重复 3次。

三、荧光定量 PCR 反应（30 uL 体系）

7. 在 PCR 管中加入下列成分（每个样品最好重复三次，这里只列出一次）：成 份 样品

6 个阳性对照（见制备 HPS 标准曲线）阴性对照

HPS 专一性引物对 2 uL 2 uL 2 uL

样品 DNA 5 uL 无 无

HPS 阳性对照 无

5 uL（每个管加一

个稀释度的对照） 无

自备 1×ROX (见注) 2 uL 2 uL 2 uL

补超纯水到 15 uL 15 uL 15 uL

即用型荧光 PCR Mix 15 uL 15 uL 15 uL

注：仅 ABI7500、7700 和 7900 仪器需要使用 ROX 作为对照，其他荧光PCR 仪器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX。此处阴性对照用的是水，用户也可以用其他大肠杆菌基因组 DNA 做阴性对照。

8. 轻柔混匀后上机，按下面参数进行定量 PCR，反应参数如下：

过程 温度 时间 其他

预变性 95℃ 5 分钟

PCR 反应

（40-50 个循环）

95℃ 20 s

62℃ 20 s

收集荧光数据，所

选择波长见注。

68℃ 20 s

溶解曲线分析判断产物特异性

加热到 95℃ 10 分钟，然后降低到 55℃后，

按 0.5℃/10s 的升幅将温度提高到 95℃，

其间记录下荧光信号的变化。特异的 HPS

PCR 扩增产物将在 84.5℃产生特异峰。

注：本产品所用荧光染料跟 DNA 结合时的最大光吸收是 500 nm，最大发射波长是 530 nm，不能 DNA 结合时最大吸收波长是 471 nm，无发射。

四、数据处理

9. 以 HPS 阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。本试剂盒提供的阳性对照浓度为 XXX 拷贝/uL，所以 1-6 管中的稀释样品浓度可以由此计算出来。再用浓度的的 log 为横轴，以 Ct 值为纵轴，通过待测样品的 Ct 值反推出样品 DNA 的浓度。

10. 如果没有自己做标准曲线，可以用本试剂的经验标准曲线方程：Ct=-3.4logX+25.4, 用户将样品所测 Ct 值放入方程式即可计算出 X（样品 DNA 浓度）。此法不是非常准确，因为仪器型号，试剂，操作误差等都会影响结果。