猫白血病病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

猫白血病病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

英文名称：Feline Leukemia Virus(FeLV)

运输：低温

保存：负20度

有效期：一年

货期：2-3周

其他：

产品介绍：

产品及特点

猫白血病病毒（Feline Leukemia Virus, FELV）会引起猫白血病，猫白血 病是一种猫常见的非创伤性致死疾病，也是一种恶性肿瘤性传染病，而且本病目 前尚无有效的治疗方法，对猫的健康造成严重损害，因此快速检测猫白血病病毒 具有重要意义。本产品基于荧光定量 RT-PCR 原理开发。它具有下列特点：

1. 一站式，用于不需要单独准备每种成分，包括引物和对照。

2. 根据 FELV 的保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性和亚型涵盖性（可 扩 A、B、C 三种 FELV 亚型），但又不会与其他病毒样品发生交叉反应。

3. 基于染料法 qRT-PCR 检测，灵敏度比常规 RT-PCR 高 10-100 倍，可以达 到至少 1000 拷贝/反应。

4. 使用一管式 qRT-PCR 技术，RT 和 PCR 两步在一个试管内完成，不需要中 间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。

5. 提供阳性对照，便于分析实验结果。

6. 本产品足够 50 次 30μL 体系的 RT-PCR，只能用于科研，不能用于临床。

运输及保存 低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。

自备试剂 样品 RNA

使用方法

一、稀释阳性对照（以 10E2-10E7 这 6 个 10 倍稀释度为例。由于标准品浓度非 常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂 盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样 品做阳性对照，只提供无传染性的的 DNA 片段作为阳性对照。

1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。用带芯枪头分别加入 45 μL 荧 光 PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。

2. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(本试剂盒提供)，充分 震荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

3. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

4. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

5. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品 RNA 的制备

6. 如果有 N 个样品，必须设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性 对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 上步制备的阳性对照 梯度稀释液中的第 4 号（浓度为 1×10E4 拷贝/μL，10μL 相当于 1 万拷贝） 再加上一定量的水作为制备的阳性对照（加水后其总体积跟样品一样，样品 体积多少取决于所用试剂盒的要求）。可以用水作为制备的阴性对照。

7. 用自选方法纯化 N+2 个样品的 RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA 提 取试剂盒兼容。本试剂盒免费赠送 15 次 RNA 病毒裂解液试用装（一管式病 毒 RNAout 的成分），

三、设置 RT-PCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）

8. 如果只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 RT-PCR 阴性对照，6 个用于 RT-PCR 阳性对照。

9. 在标记管中按下表加入各成分：

成分 N+2 个制备 所得样品 RT-PCR 阴性对照 RT-PCR 阳性 对照（2-7 管） 2×qRT-PCR 缓冲液 10μL 10μL 各 10μL 猫白血病病毒 PCR 引物混合物 2μL 2μL 各 2μL 50×ROX (见注) 0.4μL 0.4μL 各 0.4μL 样品制备所得 RNA 模 板（来于第 8 步） 5.6μL 不加 不加 稀释所得 6 个阳性对照 不加 不加 各 5.6μL（2 号样 （来于第一步） 到 2 号管，3 号样 到 3 号管…） 10×qRT-PCR 酶混合液 2μL 2μL 2μL

注:需使用 ROX 染料 I 的机型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、 Step-One、Step-One Plus。 需使用 ROX 染料 II 的机型：：ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research 的 Chromo4、Opticon（II）Corbett Rotor Gene 3000。 不需要使用 ROX 的机型：Thermal Cycle Dice Real Time System， LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene 3000、RotorGene 6000。

10. 上机后按下面参数进行 RT-PCR（参数可能会因仪器不同而需优化）。

过程 温度 时间 RT（逆转录） 50℃ 30 分钟 预变性 94℃ 2 分钟 RT - PCR 反应 （40 个循环） 95℃ 15 秒 60℃ 15 秒（采集 FAM 通道的荧光信号） 按仪器预设程序进行溶解曲线分析

四、数据处理

11. 以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测 样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。

12. 如果把试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或 等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或 等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于 或等于 40 则为阴性，如果小于 40，则为阳性。