鸭乙型肝炎病毒染料法荧光定量PCR试剂盒

鸭乙型肝炎病毒染料法荧光定量PCR试剂盒

英文名称：Duck Hepatitis B Virus(DHBV)

运输：低温

保存：负20度

有效期：一年

货期：2-3周

其他： 

产品介绍

产品及特点

鸭乙型肝炎病毒(Duck Hepatitis B virus、DHBV)属于禽嗜肝 DNA 病毒属 （ Avihepadnavirus ） ， 此 属 与 以 HBV 为代表的 正 嗜 肝 DNA 病 毒 属 （Orthohepadnavirus）同属于嗜肝 DNA 病毒科(Hepadnaviridae)。 DHBV 一直 作为研究 HBV、筛选和验证中西药物抗病毒活性的动物病毒模型，通过研究 DHBV 感 染鸭阐明了嗜肝 DNA 病毒的复制过程。在此研究中定量检测 DHBV 具有重要的意义。 本产品就是根据 DHBV 保守区设计引物而开发的高灵敏荧光定量 PCR 产品。本试剂盒 具有下列特点：

1. 根据 DHBV 的保守序列设计的专一性引物，与相关病毒无交叉反应。

2. 灵敏度比常规 PCR 高 2-3 个数量级，可以达到几百拷贝/反应。

3. 即开即用，用户只需要提供样品模板，操作简单，定量准确快速。

4. 一管式荧光定量 PCR 检测，避免后续污染。

5. 本试剂盒足够 50 次 20μL 反应体系的荧光定量 PCR。

6. 本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。 

运输及保存 低温运输、-20℃保存(A 袋试剂放样品准备区、B 袋的阳性对照最好分开放置)，有效期 一年。

自备试剂 DNA 模板、10×ROX（根据机型决定，具体见使用方法）。

使用方法 一、稀释阳性对照（以 10E2-10E7 这 6 个 10 倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高， 因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成 分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照， 只提供可以直接使用的长为 86bp 的 DNA 片段作为阳性对照。

1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 模板稀释液（最好用带芯枪头，下同）。

3. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照，充分震荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

4. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)， 充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

5. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照到 5 号管中，充分 震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

6. 换枪头，在 4 号管中加 5 μL 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照到 4 号管中，得 1×10E4 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

7. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品 DNA 的制备

8. 如果有 N 个样品，必须设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性对照）， 一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 上步制备的 PCR 阳性对照的第 4 号（浓度为 1×10E4 拷贝/μL，10μL 相当于 1 万拷贝）或第 5 号（浓度为 1×10E5 拷贝/μL，10μL 相当于 10 万拷贝）再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求 的体积一样，以此作为 PC。另外用水作为 NC。如果每次制备需要 200μL 样品， 则 PC 和 NC 的体积也必须是 200μL。

9. 用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 DNA 提取试剂盒兼 容。。也可以选购本公司的一管式病毒 DNAout 或其升级版柱式病毒 DNAout。 本试剂盒免费赠送 15 次 DNA 病毒裂解液试用装（一管式病毒 DNAout 的成分），

三、设置 qPCR 反应（20 μL 体系，在样品制备室进行）

10. 如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上 步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照，6 个用于标准曲线。如果做定性 分析，并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），1 个用于 PCR 阳性对照（用 第 4 号阳性对照稀释液，浓度为 10000 拷贝/μL）。下面只描述定量分析的步骤， 定性分析只是把 6 个标曲反应缩减成 1 个，其余不变。

11. 在 PCR 管中加入下列成分：

成分 N+2 个 样品管 PCR 阴性对照管 标准曲线管 （2-7 管） 2×qPCR MagicMix 10 μL 10 μL 各 10 μL 鸭 HBV PCR 引物混合物 2 μL 2 μL 各 2 μL 自备 10×ROX (见注) 2 μL 2 μL 各 2 μL N+2 个样品 DNA 6 μL 不加 不加 超纯水 不加 6 μL 不加 鸭HBV PCR阳性对照（2-7 号） 不加 不加 各 6μL（2 号样到 2 号管，3 号样到 3 号管…）

注:仅 ABI7500、7700 和 7900 仪器需要使用 ROX 作为对照，其他荧光 PCR 仪 器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX，则用水替代。

12. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR（具体 PCR 参数可以根据仪器不同而自行 优化）。

过程 温度 时间 预变性 95℃ 1 分钟 PCR 反应 （30 个循环） 95℃ 15 秒 60℃ 15 秒（采集 FAM 通道荧光信号 72℃ 15 秒

四、数据处理

13. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵 轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。

14. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等 于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等于 35 则为 阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于 40 则 为阴性，如果小于 40，则为阳性。