牛流行热病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

牛流行热病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

英文名称：Bovine Ephemeral Fever Virus(BEFV)

运输：低温

保存：负20度

有效期：一年

货期：2-3周

其他： 

产品介绍：

产品及特点

牛流行热病毒(Bovine Ephemeral Fever Virus，BEFV)会引起牛流行热，是一种急性热性传染病。其特征为突然高热，呼吸促迫，流泪和消化器官的严重卡他炎症和运动障碍。感染该病的大部分病牛经2日～3日即恢复正常，故又称三日热或暂时热。该病病势迅猛，但多为良性经过。过去曾将该病误认为是流行性感冒。该病能引起牛大群发病，明显降低乳牛的产乳量。该病毒会给养殖业带来较大的经济损失，因此灵敏快捷的诊断产品具有重要的意义。本产品基于PCR原理开发。它具有下列特点：

1. 一站式，用于不需要单独准备每种成分，包括引物和对照。

2. 根据牛肠道病毒的保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性。

3. 基于染料法 qRT-PCR 检测，灵敏度比常规 RT-PCR 高 10-100 倍，可以达

到至少 1000 拷贝/反应。

4. 使用一管式 qRT-PCR 技术，RT 和 PCR 两步在一个试管内完成，不需要中

间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。

5. 本产品足够 50 次 30μL 体系的 RT-PCR，只能用于科研，不能用于临床

运输及保存 低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。

自备试剂 样品 RNA

使用方法 一、样品 RNA 的制备 

用自选方法纯化 BCoV 样品的 RNA，也可以另购本公司的一管式病毒

RNAout 或柱式病毒 RNAout，上述两款产品跟本试剂盒兼容。

二、RT（逆转录）反应合成 cDNA

按照下表配制 RT 反应体系（20 uL 体系）：

成份 用量

RNA 模板（自备） 由于一般不知病毒RNA浓度,用1-10 uL即可

BCoV 专一性引物二 2 uL

RNase-free 水 补水到 13 uL

70℃保温 5 min 变性模板后立即冰浴。

RT Buffer(含 dNTP) 5 uL

37℃保温 5 min。

SuperMMLV 逆转录酶 2 uL

42℃保温 60 min。此步为 RT 反应。

70℃保温 10 min 以终止反应，然后放置在冰上待用。合成的 cDNA 可以

直接作为 PCR 模板使用，不需要纯化。

三、设置荧光 PCR 反应（50 uL 体系）

1. 配制 8-10 个浓度范围的标准品：用 DNA 稀释液将 BCoV 标准品稀释成 8-10

个浓度，待用。

2. 在 PCR 管中加入下列成分（N 跟据稀释度由客户自己决定）：

成 份 样品

标准品

（8-10 管）

阴性对照

2×qPCR Mix 25 uL 25 uL 25 uL

cDNA 样品（上步的 RT 反应液） 1-5 uL 无 无

标准品(8-10 个浓度) 无 N uL 每管 无

BCoV 专一性引物一 2 uL 2 uL 2 uL

BCoV 专一性引物二 2 uL 2 uL 2 uL

补水到 50 uL

3. 上机进行 PCR。荧光定量 PCR 反应参数为（以 ABI7500 荧光定量 PCR 仪

为参考）:

过程 温度 时间

预变性（此步用于活化热启动 Taq 聚合酶） 95℃ 30 s

PCR 反应

（35-40 个循环）

95℃ 5 s

60℃ 30 s

72℃ 10 min

熔解曲线分析

95℃ 5 s

65℃ 1 min

95℃ 15 s

50℃ 30 s

4. 根据 8-10 个标准品的 Ct 值（X 轴）和浓度（X 轴）描出标准曲线，用待测

样品 Ct 值推出其浓度。