巴尔通体通用PCR试剂盒

巴尔通体通用PCR试剂盒

英文名称：Bartonella spp.

运输：低温

保存：负20度

有效期：一年

货期：2-3周

其他： 

产品介绍：

产品及特点

巴尔通体(Bartonella spp.)感染后会引起巴尔通体病，一般称为人巴尔通体病。跳蚤、体虱、白蛉为其传播媒介，可引起人类卡瑞恩疾病、CSD、战壕热、、视神经炎、慢性淋巴结病、心内膜炎等疾病，对人体健康有较大损害，因此快速检测巴尔通体通用具有重要意义。荧光定量 PCR 是检测传染性疾病的主流技术，本产品就是以染料法荧光定量 PCR 技术为基础开发的专门检测巴尔通体通用的试剂盒，它具有下列特点：

1. 即开即用，用户只需要提供 DNA 模板。

2. 特异性高，引物是根据人巴尔通体高度保守区设计,可以扩增十余种巴尔通体（见附件），不会扩增巴尔通体之外的其他微生物。

3. 引物和扩增体系经过优化，灵敏性比常规 PCR 高 100 倍，达到 50 拷贝左右/反应。

4. 提供无传染性的 PCR 阳性对照，便于区分假阴性样品。

运输及保存 低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。

自备试剂 样品 DNA。

使用方法

一、制备标准曲线样品（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。

1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。

3. 在 7 号管中加入 5 μL 阳性对照（其浓度为 1×10E8 拷贝/μL，试剂盒提供)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

4. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

5. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品 DNA 的制备

7. 用自选方法纯化样品的 DNA，本产品跟市场上绝大多数核酸纯化产品兼容。

8. 如果有 N 个样品，则需要进行 N+2 个样品提取，多出的一个用作样品制备阳性对照管、另一个用作样品制备阴性对照管。如果用本试剂盒自带的核酸释放剂试用装，

三、设置 qPCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）

9. 如果只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照，6 个用于标准曲线样品。

10. 在标记管中按下表加入各成分：

成分

样品管

N+2 个

PCR 阴性

对照管

标准曲线

样品管（2-7 管）

2×qPCR MagicMix 10 μL 10 μL 各 10 μL

巴尔通体通用 PCR 引物

混合液

2 μL 2 μL 各 2 μL

自备 10×ROX (见注) 2 μL 2 μL 各 2 μL

N+2 个待测样品 DNA 6 μL 不加 不加

第 7 步所得标准曲线样

品稀释液（2-7 号）

不加 不加

各 6μL（2 号样到

2 号管，3 号样到 3

号管…）

注:仅 ABI7500、7700 和 7900 仪器需要使用 ROX 作为对照，其他荧光PCR 仪器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、

RotorGene 3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用ROX，则用水替代。

11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR（具体 PCR 参数可以根据仪器不同而自行优化）。

四、荧光定量 PCR 反应参数

过程 温度 时间 

预变性 94℃ 5 min

PCR 反应

（35 个循环）

94℃ 30s

54℃

30s（采集 SYBR 通道的荧光

信号）

72℃ 24s

最后延伸 72℃ 10 min

五、数据处理

12. 设定 60℃-96℃范围的融解曲线分析，排除假阳性。

13. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品DNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。

14. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。重复实验的 Ct值如果大于或等于 40 则为阴性，如果小于 40，则为阳性。

附件：用本试剂盒可以检测的巴尔通体种名

Bartonella alsatica 巴尔萨斯巴尔通体

Bartonella bacilliformis 杆菌样巴尔通体

Bartonella clarridgeiae 克氏巴尔通体

Bartonella doshiae 道志巴尔通体

Bartonella elizabethae 伊丽莎白巴尔通体

Bartonella grahamii 格拉汉姆巴尔通体

Bartonella henselae 汉赛巴尔通体

Bartonella koehlerae 克勒巴尔通体

Bartonella quintana 五日热巴尔通体

Bartonella tribocorum 特里波契巴尔通体

Bartonella vinsonii 文森巴尔通体阿鲁潘亚种

5. 一管式操作，荧光 PCR 检测，不容易产生环境污染。

6. 本产品只能用于科研，本试剂盒足够 50 次 20uL 体系的 PCR。