非洲马瘟病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

非洲马瘟病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

英文名称：African Horse Sickness Virus(AHSV)

运输：低温

保存：负20度

有效期：一年

货期：2-3周

其他： 

产品介绍：

产品及特点

非洲马瘟病毒(African Horse Sickness Virus，AHSV)会引起非洲马瘟，是 一种马属动物的急性或亚急性传染病，该病以发热、皮下结缔组织与肺水肿以及 内脏出血为特征，只能通过昆虫传播。马对此病的易感性最高，病死率高达 95%。 本病发生有明显的季节性和地域性，多见于温热潮湿季节，常呈地方流行或暴发 流行，传播迅速，因此灵敏快捷的诊断产品具有重要的意义。本公司产品开发非 洲马瘟病毒染料法荧光定量 RT-PCR 试剂盒，它具有下列特点：

1. 一站式，用于不需要单独准备每种成分，包括引物和对照。

2. 根据非洲马瘟病毒的保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性。

3. 基于染料法 qRT-PCR 检测，灵敏度比常规 RT-PCR 高 10-100 倍，可以达 到至少 1000 拷贝/反应。

4. 使用一管式 qRT-PCR 技术，RT 和 PCR 两步在一个试管内完成，不需要中 间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。

5. 本产品足够 50 次 30μL 体系的 RT-PCR，只能用于科研，不能用于临床。

运输及保存 低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。阳性对照需要因易污染其他成分需

要单独放置。本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供 DNA 片段作为阳性对照。 自备试剂 样品 RNA

使用方法 一、稀释阳性对照（以 10E2-10E7 这 6 个 10 倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原。

1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。

2. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(本试剂盒提供)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

3. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

4. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品 RNA 的制备

5. 如果有 N 个样品，必须设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 上步制备的阳性对照梯度稀释液中的第 4 号（浓度为 1×10E4 拷贝/μL，10μL 相当于 1 万拷贝）再加上一定量的水作为制备的阳性对照（加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要求）。可以用水作为制备的阴性对照。

6. 用自选方法纯化 N+2 个样品的 RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA 提取试剂盒兼容。本试剂盒免费赠送 20 次免 RNA 提取的核酸释放剂试用装，

三、设置 RT-PCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）

7. 如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照，6 个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），1 个用于 PCR 阳性对照（用第 4 号阳性对照稀释液做模板）。下面只描述定量分析的步骤，定性分析只是把 6 个标曲反应缩减成 1 个，其余不变。

8. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，阳性对照样品要等所有管子盖上盖子后最后加）：成分

N+2 个制备

所得样品

qRT-PCR

阴性对照

qRT-PCR 阳性

对照（2-7 管）

2×qRT-PCR 缓冲液 10μL 10μL 各 10μL

非洲马瘟病毒染料法

qRT-PCR 引物混合物

2μL 2μL 各 2μL

50×ROX (见注) 0.4μL 0.4μL 各 0.4μL

样品制备所得 RNA 模板

（来于第 8 步）

5.6μL - - 稀释所得 6 个阳性对照

（来于第 6 步）

- - 各 5.6μL（2 号样到 2 号

管，3 号样到 3 号管…）

超纯水 - 5.6μL - 10×qRT-PCR

酶混合液

2μL 2μL 2μL

注:需使用 ROX 染料 I 的机型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、

Step-One、Step-One Plus。

需使用 ROX 染料 II 的机型：：ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research

的 Chromo4、Opticon（II）Corbett Rotor Gene 3000。

不需要使用 ROX 的机型：Thermal Cycle Dice Real Time System，

LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene

3000、RotorGene 6000。

9. 上机后按下面参数进行 RT-PCR（参数可能会因仪器不同而需优化）。过程 温度 时间

RT（逆转录） 50℃ 15-30 min

预变性 95℃ 5 min

qRT - PCR 反应

（40 个循环）

95℃ 15 sec

58℃ 1 min（采集 FAM 通道的荧光信号）按仪器预设程序进行溶解曲线分析

四、数据处理

10. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA浓度的 log 值，再推算出其浓度。

11. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于 40 则为阴性，如果小于 40，则为阳性。