腺伴随病毒探针法荧光定量PCR试剂盒

腺伴随病毒探针法荧光定量PCR试剂盒

英文名称：Adeno-associated Virus(AAV)

运输：低温

保存：负20度

有效期：一年

货期：2-3周

其他： 

产品介绍：

产品及特点 

腺伴随病毒(Adeno-associated Virus，AAV) 属细小病毒科，病毒颗粒直径为 20nm，无包膜，20 面体，为目前动物病毒中最简单的一类单链线状 DNA病毒。在普通人群中，AAV 感染率很高，85%的人呈血清抗体阳性，但是未发现 AAV 引起人体疾病，甚至早年的流行病学研究报告认为，AAV 感染者减少了患癌的危险性，对人体医学研究具有重要意义，因此腺伴随病毒的快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用，本产品就是以探针法荧光定量 PCR 技术为基础开发的专门检测腺伴随病毒的试剂盒，它具有下列特点：

1. 即开即用，用户只需要提供样品 DNA 模板。

2. 引物和探针经过优化，灵敏性高。

3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4. 特异性高，引物是根据腺伴随病毒高度保守区设计，不会跟其他病毒的 DNA

发生交叉反应。

5. 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 PCR 反应。

6. 本产品只能用于科研。

运输及保存 低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。

自备试剂 样品 DNA。

使用方法 

一、稀释标准曲线样品（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。

1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。

3. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震

荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

4. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

5. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品 DNA 的制备

7. 如果有 N 个样品，最好设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 阳性对照的 10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为

PC。另外用水作为 NC。

8. 用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 DNA 提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的柱式病毒 DNAout。本试剂盒免费赠送 50 次免 DNA 提取的核酸释放剂试用装，该释放剂的裂解液可以直接作PCR 模 板 ，省 略了 DNA 提取 步 骤。

三、Probe qPCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）

9. 如果只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照，6 个用于标准曲线样品。

10. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：

成分

样品管

N+2 个

PCR 阴性

对照管

标准曲线

样品管（2-7 管）

2×Probe qPCR MagicMix 10 μL 10 μL 各 10 μL

腺伴随病毒 qPCR 探针 1 μL 1 μL 各 1 μL

腺伴随病毒探针法 qPCR 引物混

合液 2 μL 2 μL 各 2 μL

待测样品 DNA 模板 7 μL - -

自备超纯水 - 7 μL -

第 7 步所得标准曲线样品稀释液 - - 各 7μL（2 号样到 2

（2-7 号） 号管，3 号样到 3 号

管…）

11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR：

过程 温度 时间

预热 50℃ 2 min

预变性 95℃ 10 min

qPCR 反应

（40 个循环）

95℃ 15 sec

60℃

1 min（采集 FAM 通道的荧光

信号）

五、数据处理

12. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct

值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品

DNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。

13. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。重复实验的 Ct值如果大于或等于 40 则为阴性，如果小于 40，则为阳性。