转基因构建探针法荧光定量PCR试剂盒

转基因构建探针法荧光定量PCR试剂盒

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产品介绍：

产品及特点

CTP2-CP4-EPSPS 是 CTP2 叶绿体转运肽前导序列用于引导 CP4-EPSPS 蛋白 进入叶绿体，CP4-EPSPS 是从土壤农杆菌 CP4 菌株中分离得到的抗除草剂草甘膦基 因，是转基因植物研究中最为常用的一种筛选标记基因，因此本公司根据探针法 qPCR 原理开发了专门用于检测 CTP2-CP4-EPSPS 的试剂盒，它具有下列特点：

1. 即开即用，用户只需要提供样品 DNA 模板。

2. 根据 CTP2-CP4-EPSPS 保守区域设计引物和探针，能专一性地检测出样品中的 CTP2-CP4-EPSPS 成分，但不能检测其他非 CTP2-CP4-EPSPS 成分。

运输及保存 低温运输，-20℃保存，有效期一年。使用本试剂盒提供的阳性对照时，由于其浓度较 高，一定要注意不要污染其他试剂和成分。最好在专门的区域操作。

自备试剂 DNA 模板

使用方法 一、稀释标准曲线样品（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。由于标 准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本 试剂盒的其他成分）。

1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。

3. 在 7 号管中加入 5 μL 阳性对照（浓度为 1×10E8 拷贝/μL，试剂盒提供)，充分 震荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

4. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)， 充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

5. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)， 充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品 DNA 的制备

7. 用自选方法纯化样品的 DNA，本产品跟市场上绝大多数核酸纯化产品兼容。

8. 如果有 N 个样品，则需要进行 N+2 个样品提取，多出的一个用作样品制备阳性对 照管、另一个用作样品制备阴性对照管。如果用本试剂盒自带的核酸释放剂 试用装，则请到 www.tiandz.com 输入产品名称核酸释放剂或编号 61202 下载手册并按手册操作，制备样品。

三、设置 qPCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）

9. 如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上 步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），6 个用于标准曲 线。如果做定性分析，并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个 PCR 管，其中 N+2 个 用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），1 个用于 PCR 阳性对照（用第一步稀释得到的标准曲线系列稀释液的第 4 号做模板）。下 面只以定量分析为例描述操作步骤。

10. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复）：

成分 样品管 N+2 个 PCR 阴性 对照管 标准曲线 样品管（2-7 管） 2×Probe qPCR MagicMix 10 μL 10 μL 各 10 μL

CTP2-CP4-EPSPS 转基因元件 探针法 qPCR 探针 1 μL 1 μL 各 1 μL CTP2-CP4-EPSPS 转基因元件 探针法 qPCR 引物混合液 2 μL 2 μL 各 2 μL

N+2 个待测样品 DNA 模板 7 μL 不加 不加

超纯水 不加 7 μL 不加

第 7 步所得标准曲线样品稀释液 （2-7 号） 不加 不加 各 7μL（2 号样到 2 号管，3 号样到 3 号 管…）

四、qPCR 反应参数

过程温度 时间

预变性 95℃ 10 min PCR 反应 （40 个循环） 95℃ 15sec 60℃ 60sec（采集 FAM 通道的荧光信号）

五、数据处理

11. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵 轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。

12. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等 于 35。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 35 则为阴性，如果小于或等于 30 则为 阳性。如果在 30-35 之间，则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于 35 则 为阴性，如果小于 35，则为阳性。 

3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4. 一管式闭管操作，降低了交叉污染。

5. 快速，整个检测过程（按一个样品计）所需时间仅为 2.0 小时。

6. 本只能用于科研，足够 50 次 20uL 体系的探针法荧光定量 PCR。