一站式平末端克隆试剂盒

一站式平末端克隆试剂盒

英文名称：One-Stop Blunt-ended Cloning Kit

运输：低温

保存：负20℃

有效期：1年

货期：1-2天

其他：

产品介绍：

产品及特点 

本产品是一种能使 DNA 片段的末端平滑化、5’端的磷酸化、DNA 片段和载体的连接等诸反应高效快速完成的试剂盒。它具有下列特点：

1. 适用范围包括：由高保真 DNA 聚合酶如 Pfu、Pwo、DeepVent 等扩增而来的 PCR 产物；一些限制性内切酶如 EcoRV、SmaI 等酶切产生的 DNA片段；粘端 DNA 用 DNA 聚合酶补平后的片段。

2. DNA 片段的末端平滑化反应和 5’端的磷酸化反应可在一个反应体系中同时进行，反应时间只需 10 min。

3. 本试剂盒中还含有高效的 DNA 连接液，可在短时间内完成连接反应。

运输及保存 低温运输，-20℃保存，保存期限为一年。 

自备试剂 DNA 片段等。

使用方法 

一、用 PCR 反应液直接进行克隆时 :

Blunting Kination 反应

1. 在微量离心管中配制下列反应液。

试剂 使用量

PCR 反应液 2 μL

10×末端平滑化/磷酸化缓冲液 2 μL

末端平滑化/磷酸化 Mix 1 μL

2. 37℃反应 10 min。

3. 70℃热处理 5 min。

Ligation 反应

4. 取 3. 的溶液 5 μL 到另一个新的微量离心管中。

5. 加入 1 μL 经过去磷酸化处理的平滑末端载体 DNA（50-100 ng/μL），混合均匀。

6. 加入 6 μL 的连接反应溶液（连接反应溶液请于冰中融解，使用前混匀。

超纯水 15 μL应避免多次反复冻融。），混合。

7. 16℃反应 1 h。

8. 全量转化 100 μL 的感受态细胞。

注意：用电刺激法做细菌转化时，先用乙醇沉淀或苯酚抽提等方法置换

DNA 溶解缓冲液后再进行电转化；PCR 产物中混有非特异性 DNA 时，可

以通过琼脂糖凝胶电泳回收目的 DNA 片段；PCR 反应液最适用量 2 μL，

用量过多会降低反应效率。如需提高 DNA 用量请用乙醇沉淀法精制 DNA

片段后再进行反应。

二、用精制后的 DNA 片段进行克隆时 ：

Blunting Kination 反应

9. 在微量离心管中配制以下反应液。

试剂 使用量

DNA 片段 0.2-20 pmol

10×末端平滑化/磷酸化缓冲液 2 μL

末端平滑化/磷酸化 Mix 1 μL

超纯水 up to 20 μL

10. 37℃反应 10 min。

11. 70℃热处理 5 min。

Ligation 反应

12. 取 11. 的溶液 5 μL 到另一个新的微量离心管中。

13. 加入 1 μL 经过去磷酸化处理的平滑末端载体 DNA（50-100 ng/μL）混

合均匀。

14. 加入 6 μL 的连接反应溶液，混合。

15. 16℃反应 1 h。

16. 全量反应液用于转化 100 μL 的感受态细胞。

注意：用电刺激法做细菌转化时，先用苯酚抽提和乙醇沉淀等方法置换

DNA 溶解缓冲液后再进行电转化；插入 DNA 与载体 DNA 的摩尔数比应

为 2﹕1-10﹕1。

疑问解答 1. 连接转化效率低时，请试用下述方法进行改进。

① 确认感受态细胞的转化效率。

② 延长连接反应时间至过夜反应。

③ 连接反应后向溶液中加入 NaCl 使其终浓度为 500 mM，再做转化。

如果以上操作仍不能改善连接效率，则需对连接后的 DNA 进行纯化。

2. 当使用具有 lacZ 基因的载体克隆短链 DNA 片段时，有时即使插入了DNA 片段也会有不出现终止密码。或者阅读框不改变的情况发生，在颜色选择培养基上形成淡蓝色的单菌落。

3. 短链 DNA 克隆时，有时会出现插入内含数个串联 DNA 片段的克隆体。

4. 如果 PCR 反应过程中需要加入矿物油，则要勿将其带入后面的反应液中。带有磷酸基的 3’凹陷末端的 DNA 片段无法使用本试剂盒进行末端平滑化反应。